病毒RNA提取試劑盒說明書
RNApure Virus Kit
目錄號：K0586
運輸條件：室溫（15-25℃）。
保存條件：室溫（15-25℃）。
組分說明
Size 50
Buffer RLV 15 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
Proteinase K 12.5 mg
Proteinase K Storage Buffer 1.25 ml
RNase-Free Water 10 ml
Spin Column RS 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 50
本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產品簡介
本試劑盒采用可以特異性結合病毒 RNA的吸附柱和*的緩沖液系統，適用于從血清、血漿、尿液、腦脊液等無細胞體液及細胞培養上清液中分離病毒RNA。病毒RNA特異性地結合到硅基質膜上，而污染物則流過該膜。通過兩次高效洗滌*去除蛋白質等雜質，然后用無RNase的水或試劑盒提供的RNase-Free Water洗脫高純度的病毒RNA。由本試劑盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time RT-PCR和印跡分析等實驗。
自備試劑：無水乙醇，0.9% NaCl。
實驗前準備及重要注意事項
1．向Proteinase K中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。
2．預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應使用無RNase的水。
4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
3．血清或血漿避免反復凍融導致蛋白變性或產生沉淀，減少病毒滴度進而影響提取病毒核酸的產量。
4．第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。
5．Buffer RLV如果產生沉淀，可在56℃加熱使其溶解后室溫放置。
6．所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。
操作步驟
1．室溫下取200 μl血清或血漿加到1.5 ml離心管（自備）中。
注意：不足200 μl可以加入0.9 % NaCl（客戶自備）補足。
2．向上步溶液中加入20 μl Proteinase K，混勻。
3．加入200 μl Buffer RLV，渦旋震蕩15秒。
注意：不要直接把Proteinase K加到Buffer RLV中。
4．56℃孵育15分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
5．加入250 μl無水乙醇，渦旋震蕩15秒，室溫孵育5分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
6．將步驟5得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入，8,000 rpm（~6000 ×g）離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7．向吸附柱中加入500 μl Buffer RW1，8,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
8．向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇），8,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9．向吸附柱中加入500 μl無水乙醇，8,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10.12,000 rpm (~13,400×g)離心3分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。
注意：1）這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）。
2）推薦步驟：將吸附柱放入一個新的1.5 ml離心管（自備）中，打開管蓋，56℃烘箱孵育3分鐘，使吸附柱的膜*干燥。
11.將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50 μl RNase-Free Water，室溫放置5分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1）RNase-Free Water體積不應小于20 μl，體積過小影響回收率。
2）如果要提高RNA的產量，可用20-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟11。
3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟11。
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