磺胺多殘留快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物磺胺類藥物的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.4ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時間： 30min～15min
樣本檢測下限
組 織（高 檢 測 限 方 法） ··············· 0.4 ppb
蜂 蜜 ················································0.4 ppb
血 清 、尿 液 ··································· 1.6 ppb
牛 | 奶 ········································· | 8 ppb |
u | 交叉反應(yīng)率 |
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磺胺甲基嘧啶（SM1 ） ························· | 100% | |
磺胺嘧啶（SD 或 SDZ）························· | 130.2% | |
磺胺間（六）甲氧嘧啶（SMM）················ 181.8%
磺胺甲噁唑（SMZ）······························ 86.6%
磺胺異噁唑（SIZ）······························· 76.5%
磺胺噻唑（ST）·································· 103.3%
磺胺喹噁林(SQX) ···························· | 59.4% |
磺胺甲氧噠嗪(SMP) ···························· | 68.6% |
磺胺氯吡嗪(Esb3)······························· | 72.1% |
磺胺氯噠嗪(SCPA)······························ | 49.6% |
磺胺對甲氧嘧啶（SMD）····················· 194.8% | |
磺胺二甲基嘧啶（SM2） ···················· | 79.3% |
磺胺二甲異嘧啶（SM2′）·················· | 100.6% |
磺胺間二甲氧嘧啶（SDM） ················· | 140.8% |
磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM′） ·············· 132.1%
磺胺多辛（SDM2）······························ 144.7%
酞酰磺噻唑（PST）································ 73.9%
磺胺苯酰（SML）································· 104%
磺胺咪(SG) ········································ 0.1%
由反應(yīng)交叉率可以得出：該試劑盒可用于磺胺多種殘留物的檢測，*國家磺胺類多殘留種類檢測的要求。
樣本回收率
組 | 織 、尿 樣、牛 奶 ··············· | 85% ±25% | |||
蜂 蜜、血 清 ··························· | 80% ±23% | ||||
三、試劑盒組成 |
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| 1 |
| 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.4ppb |
| 2 |
| 0.8ppb | 1.6ppb | |
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| （1ml/瓶） | |||
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| 3.2ppb | 6.4ppb | |
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| 3 |
| 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
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| 4 |
| 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
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| 5 |
| 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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| 6 |
| 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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| 7 |
| 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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| 8 |
| 20X 濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
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| 9 |
| 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、刻度移液管
微量移液器：單道 20µl～200µl、單道 100µl～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、Na2HPO4·12H2O、乙qing、NaH2PO4·2H2O、K2HPO4·3H2O、二氯甲wan、正己烷
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液 1 0.1M K2HPO4 溶液稱取 11.4g K2HPO4·3H2O 用去離子水500ml 溶解。配液 2 0.02M PB 緩沖液稱取 5.16g Na2HPO4·12H2O 和 0.87gNaH2PO4·2H2O 加去離子水 1L 溶解。
配液 3 乙qing-二氯甲*烷混合液
V 乙qing-V 二氯甲*烷 = 1 : 4
配液 4 樣本復(fù)溶液：將 20X 濃縮復(fù)溶液用去離子水 1：19 稀釋。
- 樣本處理：
（a）組織高檢測限處理方法一
1、稱 2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于 50ml 離心管中；加入 8ml 乙qing-二氯甲*烷混合液，振蕩 2min， 4000r/min 以上，15℃離心 10min；
2、取 4ml 清澈有機相至干燥容器中，50-60℃氮氣或空氣吹干；3、用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷 1ml。混合 30s，4000r/min 以上 15℃離心5min；去除上層正己烷；4、取下層 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1 倍
（b）組織高檢測限處理方法二
1、稱取 3±0.05g 勻漿物置離心管中，先加入 3ml0.02M PB 緩沖液充分振蕩混勻，再加入 4ml 乙酸乙酯和 2ml 乙qing，充分振蕩 10min，于 15℃ 4000r/min 以上速度離心 10min；
2、移取 2ml 上層液體（約相當于 1g 的樣本）在50-60℃氮氣或空氣吹干；
3、加入 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加入 1ml 樣本復(fù)溶液強烈振蕩 1min，室溫 4000r/min，離心 5min，除去上層正己烷；
4、取下層 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1 倍
（c）血清處理方法
1、將血樣本于室溫放置 30min，于 10℃，4000r/min以上離心 10min，分離出血清或過濾血清；
2、取 1ml 血清，加入 3ml 0.02 M PB 緩沖液混合，混合 30s；3、取 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4 倍
（d）蜂蜜處理方法
1、稱取 2±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中，加入2ml 0.1M K2HPO4 溶液，渦旋震蕩 2min；
2、再加入8ml 乙酸乙脂，渦旋振蕩3min，4000r/min以上 15℃離心 10min；3、取 4ml 上層液體于 56℃下氮氣吹干，加 1ml 樣本復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋震蕩 1min；4、取 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1 倍
（e）尿液處理方法
1、用 3ml0.02 M PB 緩沖液與 1ml 經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合 30s；2、取 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 4 倍
（f）牛奶處理方法
1、取 1ml 牛奶樣本用 0.02 M PB 緩沖液按 1︰19（v/v）稀釋（即 20µl 牛奶+380µl 0.02 M PB 緩沖液），混合 30s；2、取 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 20 倍
六、酶標免疫分析程序:
- 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。
3、配液：將 40ml 20X 濃縮洗滌液用去離子水稀釋至 800ml。
4、編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。
6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243； 0.4ppb 為 1.816；0.8ppb 為 1.415； 1.6ppb 為 0.74；3.2ppb 為 0.313；6.4ppb 為 0.155。
則樣本 1 的濃度范圍是 3.2ppb～6.4ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.8ppb～1.6ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第-個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以磺胺類藥物
標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
3、單項磺胺類檢測結(jié)果計算
將按照試劑盒計算出來的結(jié)果乘以相應(yīng)的交叉反應(yīng)率即為磺胺單項的檢測值。
八、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。
2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
